Pee-wee's Big Holiday'te, Pee-wee Herman sakin ve düzenli yaşamını sürdürmektedir. Gizemli bir yabancıyla tanışınca ilk kez tatile çıkmaya karar vermektedir. Bu yolculukta yoldan geçen insanlarla karşılaşmakta, beklenmedik duraklarda konaklamakta ve her adımda yeni bir sorunla uğraşmaktadır. Pee-wee, yol boyunca arkadaşlık kurmakta, bazı kişilerle ters düşmekte ve kendisini hiç planlamadığı durumların içinde bulmaktadır. Tatil, onun için yalnızca evden uzaklaşmak değil, aynı zamanda yeni insanlarla tanıştığı ve kendi sınırlarını yokladığı bir yolculuk olmaktadır. Filmin kadrosunda Paul Reubens, Joe Manganiello, Jessica Pohly, Alia Shawkat ve Stephanie Beatriz yer alıyor.