Mario, Brooklyn'de tesisatçı olarak çalışan genç bir adamdır. Luigi ile birlikte yeraltındaki ana su borusunu onarırken gizemli bir boruya düşer ve kendini Mantar Krallığı'nda bulur. İki kardeş ayrı yerlere savrulur. Mario, Luigi'yi bulmak için yola çıkar. Yolda Toad ile karşılaşır, onun yardımıyla krallığı tanır. Ardından Peach ile çalışır, eğitim alır ve karşısına çıkan tuzakları aşmayı öğrenir. Yol boyunca canavarlarla, dar geçitlerle ve zor bölgelerle uğraşır. Mario ilerledikçe daha cesur davranır ve Luigi'ye ulaşmak için durmadan yoluna devam eder. Başrollerde Chris Pratt, Anya Taylor-Joy, Charlie Day, Jack Black ve Keegan-Michael Key yer alıyor.